Utlizzo dell'inchiostro di china nell'osservazione di alcune comuni amebe.

Molti degli organismi microscopici che si rinvengono all’interno di un acquario d’acqua dolce, se osservati in campo chiaro, possono risultare davvero poco contrastati sino al punto da confondersi col fondo. In questo caso non solo l’osservazione è difficoltosa ma anche un’eventuale  ripresa fotografica. Per ovviare alla cosa, nell’impossibilità di potersi avvalere di tecniche quali il contrasto di fase, si può ricorrere a delle semplici metodiche di colorazione certamente alla portata di tutti. Quella che si vuole qui proporre è una tecnica di colorazione negativa, così definita in quanto capace di lasciare incolore il materiale protoplasmatico ma non tutto ciò che vi sta intorno. Il colorante da utilizzare è semplicemente dell’inchiostro di china blu o nero non solo di facilissima reperibilità ma anche di costo contenuto (qualche euro). A fronte di questo, i risultati non solo possono essere altamente spettacolari, ma rivelarsi al contempo di una certa utilità in varie applicazioni.

Figura 1. A sinistra, ameba del genere Chaos fotografata dopo colorazione con inchiostro di china nero. La freccia indica i resti del mastax di un  rotifero, 400x. A destra,  boccettino d’inchiostro di china blu.

Le amebe

Tutti quei protozoi che nelle forme mature emettono estroflessioni fluide del corpo dette pseudopodi possono essere riuniti in quello che tradizionalmente costituisce il phylum Sarcodina. All’interno di un acquario d’acqua dolce due dei quattro gruppi costituenti il taxon, sono ben rappresentati: amebe ed eliozoi.
Le amebe possono presentarsi sia nude che racchiuse all’interno di un guscio definito teca.
Possiamo considerare quale principale caratteristica delle amebe quella di possedere un corpo la cui morfologia è soggetta ad un continuo cambiamento. Le dimensioni possono andare da pochi μm sino ad alcune centinaia di μm (in natura esistono tuttavia esemplari capaci di arrivare a misurare alcuni millimetri).
Gli pseudopodi si possono distinguere in lobopodi e filopodi. I primi, piuttosto evidenti, sono caratteristici della maggior parte delle amebe e sono caratterizzati da estremità arrotondate o tozze. In questi è chiaramente distinguibile una regione interna più densa, l’endoplasma, ed una esterna più ialina, l’ectoplasma. I filopodi terminano invece appuntiti e vi si ravvisa la sola presenza di ectoplasma. In alcune specie possono essere ramificati.
Nelle amebe dotate di teca (tecamebe), questa o è secreta dal citoplasma (nel qual caso è chitinosa o silicea) oppure è costituita da materiali estranei (ed esempio frustoli di diatomee) inglobati in una matrice cementante. Bande protoplasmatiche consentono all’ameba di aderire alla teca. Nella teca si riscontra sempre la presenza di un’apertura più o meno ampia da cui l’organismo può emettere pseudopodi.
Le amebe, ad eccezione di alcune forme in grado di condurre vita parassitaria, sono organismi olozoici. Come tali si alimentano di batteri, alghe protozoi e di piccoli animali (ad es. rotiferi).
La riproduzione asessuata avviene per scissione binaria. Quella sessuale è stata osservata solo raramente.

Preparazione del vetrino

Con l’ausilio di una pipetta in plastica, occorre prelevare un po’ di detriti dal fondo di un acquario o da un filtro in funzione da almeno un paio di settimane. Si suggerisce di prestare anche una particolare attenzione alla patina oleosa facilmente riscontrabile in un classico filtro interno a scomparti. Spesso in questi biofilm, infatti, non è difficile riuscire a rinvenirvi numerose piccole amebe o tecamebe. Ideale, però, sarebbe allestire delle apposite colture utilizzando foglie di piante d’acquario. In simili colture, non è, infatti, raro vedere svilupparsi grosse amebe del genere Metachaos.
Il materiale così raccolto, va distribuito in piccole gocce al centro di alcuni vetrini portaoggetti preventivamente ben puliti e sgrassati di modo da poterlo esaminare al microscopio a basso ingrandimento. Le tecamebe più grosse appaiono come delle macchie scure di forma tondeggiante ben contrastate e, dunque, facilmente individuabili. Per quelle più piccole occorre accertarsi della presenza utilizzando ingrandimenti più forti.

Figura 2. L’ameba ritratta nell’immagine si staglia su di uno sfondo colorato di un intenso blu. L’inchiostro di china non penetra nel protoplasma e questo consente di ottenere effetti suggestivi (ma anche non privi di una certa utilità) come quello osservabile.

Scelta la preparazione col materiale più interessante, si impugna un  vetrino coprioggetti tra indice e pollice della mano destra e lo si pone a contatto con l’acqua del preparato di modo che s’instauri una certa tensione superficiale. Aiutandosi con le pinzette per non farlo scivolare, si tiene fermo il bordo del coprioggetti a contatto col vetrino portaoggetti e lo si adagia sino a dove possibile in maniera graduale e lenta.
Si tratta questa di un’operazione critica che, almeno le prime volte, può risultare alquanto difficoltosa. Tuttavia, col tempo non è difficile acquisire  quella necessaria manualità capace di farci compiere al meglio questo delicato passaggio.
Al termine delle operazioni sopra esposte, qualora l’acqua risulti troppa, si pone facilmente rimedio assorbendone l’eccesso per mezzo di carta assorbente. All’opposto se l’intercapedine tra vetrino portaoggetti e vetrino coprioggetti non è interamente occupata d’acqua si deposita una goccia d’acqua sul portaoggetti a contatto col coprioggetti che, per capillarità, viene richiamata al di sotto di quest’ultimo.
Quasi sempre ci troveremo ad affrontare condizioni caratterizzate da un eccesso d’acqua a cui è bene porre rimedio in virtù anche del fatto che si andrà ad aggiungere una certa quantità di colorante.

Figura 3. La colorazione con inchiostro di china mette ben in evidenza quello che è il materiale protoplasmatico all’interno della teca. Centropyxis sp., 400x.

La tecnica di colorazione è stata applicata a 4 generi di amebe: Metachaos, Chaos, Centropyxis ed Euglypha. Nel caso specifico, tutte le amebe sono state prelevate da colture con foglie di Bacopa caroliniana.
Una volta allestito il vetrino, come indicato nel precedente paragrafo, si preleva una piccola quantità d’inchiostro di china nero per mezzo di una pipetta di Pasteur munita di tettarella. Una perfetta distribuzione del colorante, una volta posta una piccola goccia a contatto del vetrino coprioggetti, si garantisce assorbendo l’acqua all’estremità opposta per mezzo di carta assorbente. A questo punto il preparato appare molto scuro. Si tratta solo di attendere qualche minuto sino a quando l’intensità della colorazione si attenua (l’inchiostro si va ad accumulare lungo i bordi del vetrino coprioggetti).
Dopo aver posizionato il vetrino sul tavolino portaoggetti, si utilizza il sistema di coordinate per fare in modo che il preparato venga posto in corrispondenza del condensatore variabile. Come sempre un primo esame è da effettuarsi a basso ingrandimento (40x – 60x). Una volta individuato un esemplare interessante  si passa subito ad un ingrandimento maggiore. In genere un’osservazione tra i 200 e 400 ingrandimenti è quella ideale per  consentirci  di cogliere i principali dettagli di questi protisti.

Figura 4. Malgrado l’inchiostro di china sia stato diluito 1 a 10 con acqua distillata gli effetti sono ancora ben evidenti su questa piccola tecameba del genere Euglypha.

Nell’osservazione a 400 ingrandimenti è spesso necessario aumentare l’intensità della fonte di luce del microscopio, portandola al massimo livello.

Conclusioni

In conclusione di questo breve articolo, non si può che esortare alla sperimentazione di questa semplice quanto economica tecnica estendendo il campo d’applicazione anche ad altri soggetti. Ciliati ed “alghe” (in particolare ove presente un guscio gelatinoso) ben si prestano al trattamento.